蛋白質(zhì)這一新技術(shù)為科研人員深入了解活細(xì)胞中蛋白質(zhì)組半衰期動(dòng)力學(xué)開辟了新途徑。
清除不必要或有害的蛋白質(zhì)是細(xì)胞進(jìn)行自身調(diào)控的重要途徑之一。在生物體中主要通過兩種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)：一種是通過蛋白酶體降解蛋白質(zhì)，而另一種則是以細(xì)胞生長的方式對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行稀釋。快速分裂的細(xì)胞例如細(xì)菌主要是依賴“稀釋”的方式，而終末分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞則主要是通過蛋白質(zhì)降解的途徑。“由于蛋白質(zhì)的清除途徑通常取決于細(xì)胞的類型，科學(xué)家們常常忽略了降解和稀釋之間存在的平衡關(guān)系
脈沖追蹤術(shù)和蛋白質(zhì)合成抑制法來檢測蛋白質(zhì)的降解速率。盡管脈沖追蹤術(shù)已被應(yīng)用了數(shù)十年，然而由于這種方法需要使用放射性標(biāo)記和蛋白特異性抗體，使其應(yīng)用范圍受到很大的限制；而蛋白質(zhì)合成抑制劑則有可能會(huì)擾亂細(xì)胞的功能
在這篇文章中研究人員開發(fā)了一種檢測蛋白質(zhì)半衰期的新技術(shù)，將其命名為“漂白追蹤”（bleach-chase）術(shù)。他們首先利用熒光YFP標(biāo)簽標(biāo)記目的蛋白，進(jìn)而利用短暫的閃光脈沖使10-60%的熒光基因失去熒光（即所謂“漂白”）,由于時(shí)間短暫因此不會(huì)對細(xì)胞造成影響。
“漂白促使標(biāo)記蛋白分為了兩種亞群：熒光蛋白和非熒光蛋白。而理論上漂白后細(xì)胞不會(huì)再合成新的非熒光蛋白，熒光的衰減則只可能是依賴于蛋白質(zhì)清除，”Eden解釋說：“我們利用熒光時(shí)差顯微術(shù)對漂白細(xì)胞和非漂白細(xì)胞進(jìn)行了觀測，通過比較兩種細(xì)胞中的熒光水平改變從而獲得了非熒光蛋白的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。”
‘漂白追蹤’術(shù)除了能準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)的半衰期，還能幫助科學(xué)家鑒別哪些蛋白發(fā)生了活性降解，哪些蛋白則隨細(xì)胞分裂而發(fā)生了稀釋，”Eden說：“我們在試驗(yàn)中針對人類癌細(xì)胞中100種不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行了降解和稀釋分析，發(fā)現(xiàn)在檢測時(shí)間段中48%的蛋白質(zhì)出現(xiàn)了降解，10%的蛋白質(zhì)發(fā)生了稀釋，而42%的蛋白則同時(shí)存在降解和稀釋。”
在進(jìn)一步的研究中，Eden等利用一種化療藥物對細(xì)胞施加壓力以減慢細(xì)胞的生長速率，觀測這一效應(yīng)對于蛋白質(zhì)清除的影響。研究人員觀察到盡管短半衰期蛋白質(zhì)沒法發(fā)生變化，但長半衰期蛋白質(zhì)則經(jīng)過更長時(shí)間的稀釋在更大程度上被清除。當(dāng)他們檢測以不同速率減慢細(xì)胞生長的其他壓力時(shí)，觀察到了相同的效應(yīng)。“我們認(rèn)為這是一種相當(dāng)普遍的現(xiàn)象，”Eden說：“這一簡單原理幫助我們更深入地了解了對應(yīng)不同壓力時(shí)蛋白質(zhì)清除率變化。值得注意的是，研究結(jié)果表明細(xì)胞并沒有利用蛋白質(zhì)降解來補(bǔ)償稀釋率的變化。
“相比于常規(guī)的脈沖追蹤術(shù)完成這些試驗(yàn)非常的簡單，并且可以更快速地生成結(jié)果。它使得科學(xué)家們能夠真正實(shí)現(xiàn)大規(guī)模蛋白質(zhì)半衰期檢測，”Eden指出：“然而其存在的*缺點(diǎn)就是蛋白質(zhì)必須首先進(jìn)行熒光標(biāo)記，這有可能會(huì)對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)清除產(chǎn)生影響，但我們已非常小心的利用脈沖追蹤對比試驗(yàn)排除了這種可能性。”
相信隨著熒光標(biāo)記蛋白庫日益廣泛地應(yīng)用于越來越多的生物體，這項(xiàng)新技術(shù)也將顯示出更加廣泛的用途。
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